동물 BSL-3 실험실 에어로졸 위험 관리의 주요 워크플로 단계는 무엇인가요?

동물 생물안전 3등급(ABSL-3) 실험실에서 에어로졸 위험을 관리하는 것은 매우 까다로운 운영 과제입니다. 절차적 체크리스트 이상의 것을 요구하며, 엔지니어링 제어, 동물 생리학 및 규정 준수가 융합된 역동적이고 통합된 워크플로우가 필요합니다. 격리 또는 투약에서 한 번의 실수로 인해 연구의 무결성이 손상되고 연구원이 위험에 처할 수 있으며 심각한 규제 결과를 초래할 수 있습니다.

최신 생물안전 지침에서 중앙집중식 위험 관리 모델로 전환함에 따라 기관 팀에 더 큰 책임이 주어졌습니다. 이제 성공은 시설 설계, 실시간 데이터, 자동화된 시스템 간의 상호 의존성에 대한 깊은 이해에 달려 있습니다. 이 문서에서는 이러한 복잡한 연구를 조율하는 전문가를 위해 원칙을 실행 가능한 프로토콜로 전환하는 중요한 워크플로 단계를 자세히 설명합니다.

ABSL-3에서 에어로졸 위험 관리의 핵심 원칙

격리 계층 구조

효과적인 관리는 다층적 방어를 기반으로 합니다. 1차 봉쇄는 기밀 등급 III 생물안전 캐비닛(BSC)을 통해 절대적으로 이루어집니다. 2차 격리는 방향성 공기 흐름, 밀폐된 관통부, 음압 구배와 같은 시설 엔지니어링에 의존합니다. 이 계층 구조는 감염성 에어로졸과 실험실 환경 사이에 여러 개의 독립적인 장벽이 존재하도록 보장합니다. 시스템의 무결성은 검증된 가장 약한 밀봉 또는 절차만큼만 강력합니다.

위험 관리 사고방식 채택

현대의 생물안전은 엄격한 규칙을 넘어서는 방향으로 나아가고 있습니다. 이제 지침은 기관의 생물안전 위원회가 현장 및 활동별 평가를 수행하는 성과 기반의 위험 관리 접근 방식을 강조합니다. 이 원칙은 폐기물 처리부터 장갑 무결성 검사에 이르기까지 모든 절차적 단계를 역동적이고 내부 주도적인 안전 문화의 렌즈를 통해 바라볼 것을 요구합니다. 주요 기관의 연구에 따르면, 안전 프로토콜을 특정 에이전트의 특성과 실험 설계에 맞게 조정하는 살아있는 프레임워크가 아닌 정적인 문서로 취급하는 것이 일반적인 실수입니다.

시스템과 인적 요소의 통합

마지막 단계는 운영 통합입니다. 엔지니어링 제어는 엄격한 교육 및 절차적 안무와 원활하게 결합되어야 합니다. 간과하기 쉬운 세부 사항으로는 슈트 랩과 캐비닛 랩 직원 간의 커뮤니케이션 동기화 또는 격리 위반 대응 중 명확한 역할 할당 등이 있습니다. 제 경험상 가장 탄력적인 ABSL-3 프로그램은 기술 시스템과 인간 운영자를 하나의 상호 의존적인 단위로 취급하며, 두 가지 모두를 테스트하는 지속적인 훈련 시나리오를 제공합니다.

사전 실험 계획 및 실험실 설정 프로토콜

다중 영역 작업 동기화

사전 실험 계획은 워크플로 성공의 중요한 결정 요인입니다. 일반적으로 동물 시술 구역과 클래스 III BSC를 보관하는 캐비닛 실험실 등 서로 다른 실험실 구역 간에 세심한 조율이 필요합니다. 시설 설계는 이러한 실험실 간 조율을 핵심 운영 요구 사항으로 우선순위를 정해야 합니다. 실험을 시작하기 전에 동물, 장비, 샘플에 대한 명확한 커뮤니케이션 프로토콜과 재료 이동 경로를 설정하는 것은 격리 및 워크플로 유동성을 유지하기 위해 타협할 수 없는 필수 요소입니다.

기본 엔지니어링 제어 확인

클래스 III BSC의 무결성은 안전의 초석입니다. 설치 프로토콜은 엄격한 사용 전 검증을 요구합니다. 기술자는 캐비닛의 음압이 일반적으로 -0.5~1.0인치 수위계 사이에서 유지되는지 확인하고 모든 장갑과 슬리브 부착 씰에 대해 철저한 무결성 검사를 수행해야 합니다. 이와 동시에 화학 덩크 탱크와 같은 액체 유출물 오염 제거 시스템을 준비하고 통과 고압 멸균기가 작동하는지 확인합니다. 업계 전문가들은 이 검증을 단순한 체크리스트가 아니라 1차 봉쇄 시스템의 진단 절차로 취급할 것을 권장합니다.

지원 시스템 준비 상태 확인

지원 시스템도 병행하여 검증해야 합니다. 여기에는 통과 고압멸균기의 통합 폐수 오염 제거 시스템이 제대로 작동하는지 확인하는 것이 포함되며, 이는 최신 BSL-3 설계에서 타협할 수 없는 사양입니다. 혈류계부터 샘플 용기에 이르기까지 필요한 모든 장비는 각 구역에 배치되어 실험이 진행되는 동안 이동을 최소화합니다. 다음 표에는 이 단계에서 필요한 주요 시스템과 점검 사항이 요약되어 있습니다.

중요한 사전 작업 점검

감염성 물질이 유입되기 전에 일련의 검증된 검사를 완료해야 합니다. 이를 통해 모든 격리 및 오염 제거 경로가 준비되었는지 확인합니다.

출처: 미생물학 및 생물의학 실험실에서의 생물안전(BMBL) 6판. BMBL은 ABSL-3에서 작업을 시작하기 전에 오염 제거 시스템의 1차 격리 무결성 및 기능 검증을 의무화하여 나열된 점검 및 사양을 직접 지원합니다.

동물 준비 및 호흡기 매개변수 측정

안정적인 호흡을 위한 마취

동물 실험 준비는 정확한 호흡 측정을 위해 안정적이고 마취된 상태를 만드는 데 중점을 둡니다. 인간이 아닌 영장류의 경우 호흡 억제를 최소화하도록 특별히 고안된 마취 프로토콜을 사용합니다. 목표는 전달된 에어로졸 용량을 계산하기 위한 기초 지표인 호흡량과 호흡 속도를 일관되게 제공하는 생리적 상태를 유지하는 것입니다. 이송 및 노출 내내 이러한 안정성을 유지하려면 마취 깊이를 주의 깊게 모니터링해야 합니다.

주요 생리적 파라미터 측정

마취된 동물은 폐활량과 호흡 빈도를 측정하기 위해 흉부 심전도 검사를 받습니다. 이 값으로부터 호흡 분량(MV)이 계산됩니다. 이 데이터는 단순히 연구 기록을 위한 것이 아니라 절차상 필수적인 입력입니다. MV는 에어로졸 챌린지 시간의 실시간 계산에 직접적으로 영향을 미치며, 생리적 데이터가 후속 고농도 노출의 매개변수를 결정하는 중요한 의존성을 형성합니다. 이 단계는 에어로졸 제어 소프트웨어에 직접 공급되는 통합 데이터 시스템의 필요성을 강조합니다.

데이터를 노출 파라미터로 변환

계산된 분당 부피가 투여량 방정식의 핵심 변수가 됩니다: 용량 = 에어로졸 농도 x 분량 x 시간. 목표 용량을 달성하기 위해 개별 동물의 MV와 특성화된 에어로졸 농도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 이러한 맞춤형 투여 방식은 연구의 재현성과 동물 복지를 위해 매우 중요합니다. 아래 표에는 측정된 파라미터와 워크플로에서 직접적인 역할이 자세히 나와 있습니다.

기본 투약 지표

정확한 투여량은 동물의 호흡 기능을 정밀하게 측정하는 데 달려 있습니다. 이러한 매개변수는 생물학적 과정을 노출 시스템을 위한 정량화 가능한 입력으로 변환합니다.

출처: PAS(공개 사용 가능 사양) 2019:2019 실험동물 에어로졸 노출 시스템. 이 사양은 이 표의 데이터의 핵심 목적인 정확하고 재현 가능한 에어로졸 투여를 보장하기 위해 동물 호흡 매개변수를 정확하게 측정해야 할 필요성을 간략하게 설명합니다.

에어로졸 시스템 조립, 특성화 및 모의 실행

노출 시스템 조립하기

보안이 유지되는 클래스 III BSC 내부에서 기술자가 에어로졸 생성 및 노출 시스템을 조립합니다. 일반적인 설정은 네뷸라이저, 실시간 모니터링을 위한 공기역학적 입자 크기 측정기, 동적 헤드 전용 노출 챔버를 통합합니다. 캐비닛 오염을 방지하고 에어로졸 전달의 무결성을 보장하기 위해 모든 연결부는 누출이 없어야 합니다. 이 조립 프로세스는 실험 실행 간의 일관성을 보장하기 위해 표준 운영 절차를 엄격하게 준수해야 합니다.

에어로졸 클라우드 특성 분석

조립 후 병원체 또는 적절한 시뮬란트를 사용한 모의 실험을 실시합니다. 이 중요한 단계에서는 에어로졸의 안정성, 생존력, 입자 크기 분포가 결정됩니다. 목표는 일반적으로 1~5미크론 사이의 질량 중앙 공기역학적 직경(MMAD)을 가진 호흡 가능한 에어로졸을 생성하는 것입니다. 입자 크기 측정기의 데이터는 동물 노출이 시작되기 전에 에어로졸 구름이 안정적이고 균질한지 확인합니다. 실시간 입자 모니터링이 있는 시스템과 없는 시스템을 비교한 결과, 후자의 경우 전달되는 선량에 허용할 수 없는 변동성이 발생하는 것으로 나타났습니다.

자동 제어의 역할

이 단계에서는 에어로졸 생성, 모니터링, 때로는 투약량 계산을 중앙에서 제어하는 자동화된 에어로졸 관리 플랫폼(AAMP)이 점점 더 많이 사용되고 있습니다. AAMP는 정밀도를 높이고 수동 개입을 줄이지만, 시스템 안정성과 사이버 보안이라는 새로운 잠재적 병목 현상을 초래합니다. 향후 운영 효율성은 이러한 자동화된 시스템에 대한 강력한 엔지니어링 지원과 전문 기술 유지보수로 전략적 투자 방향을 전환하는 데 달려 있습니다.

시스템 구성 요소 및 성능 목표

에어로졸 시스템의 각 구성 요소에는 최종 특성화된 출력에 기여하는 정의된 기능이 있습니다. 이러한 부품의 통합은 모의 실행 중에 검증됩니다.

참고: 자동화된 에어로졸 관리 플랫폼(AAMP)은 이러한 구성 요소의 제어를 중앙 집중화합니다.

출처: PAS(공개 사용 가능 사양) 2019:2019 실험동물 에어로졸 노출 시스템. PAS 2019는 노출 챔버와 같은 구성 요소의 설계 및 성능에 대한 사양을 제공하고 챌린지 연구를 위한 일관되고 호흡 가능한 에어로졸 생성을 보장하기 위한 특성화 실행을 의무화합니다.

동물 에어로졸 노출 실행하기: 단계별 가이드

동물 이동 및 챔버 봉인

노출 단계는 조율된 위험 관리의 정점을 나타냅니다. 마취된 NHP는 신속 이송 포트(RTP)와 같은 안전한 통로를 통해 준비 구역에서 클래스 III BSC로 이송됩니다. 캐비닛 내부에서 동물의 머리는 노출 챔버의 포트에 조심스럽게 밀봉됩니다. 이 밀봉은 에어로졸이 BSC 작업 공간으로 누출되는 것을 방지하고 생성된 에어로졸 구름에서 흡입된 모든 공기가 배출되도록 하는 데 매우 중요합니다.

챌린지 시작 및 모니터링

챌린지는 미리 계산된 노출 시간을 기준으로 시작됩니다. 에어로졸 농도 안정성을 확인하기 위해 실시간 입자 모니터링이 계속 진행됩니다. 담당자는 동물의 생리적 상태와 시스템의 성능 메트릭을 지속적으로 관찰해야 합니다. 이 단계에서는 이전에 완료된 계획, 측정 및 특성화 단계의 원활한 통합을 테스트합니다. 편차가 발생하면 사전에 정의된 즉각적인 대응이 필요합니다.

격리 위반 관리

중요한 역량은 찢어진 BSC 장갑과 같은 1차 봉쇄 위반을 관리하는 것입니다. 최신 프로토콜은 이를 자동 시설 대피 트리거가 아닌 특정 교육이 필요한 관리형 사고로 취급합니다. 즉각적인 대응에는 캐비닛 음압을 유지하면서 영향을 받은 포트를 격리하고, 해당 구역의 오염을 제거하고, 안전한 장갑 교체 절차를 실행하는 것이 포함됩니다. 이 접근 방식은 안전을 우선시하면서 운영 중단을 최소화합니다.

노출 후 오염 제거, 샘플링 및 폐기물 처리

샘플 및 1차 폐기물 확보

노출 후 절차는 모든 감염성 물질이 격리실 내에서 비활성화되도록 합니다. 용량 검증을 위한 에어로졸 샘플은 BSC 내에서 밀봉되어 적정을 위해 반출됩니다. 장갑, 면봉, 커튼 등 오염된 모든 고체 폐기물은 BSC 내의 생물학적 위험물 봉투에 넣습니다. 그런 다음 이 폐기물은 검증된 멸균 주기를 위해 통과 고압 멸균기에 직접 적재됩니다. 이러한 물질을 취급할 때는 2차 에어로졸이 발생하지 않도록 신중하게 움직여야 합니다.

폐수 및 최종 오염 제거

네뷸라이저 또는 세척 공정에서 발생하는 액체 폐기물은 화학 폐수 오염 제거 시스템으로 보내집니다. 폐기물 처리 후, 전체 BSC 내부와 노출된 모든 장비는 기화 과산화수소(VHP)와 같은 검증된 기체 오염 제거 사이클을 거칩니다. 이 사이클의 성공 여부는 캐비닛 내 까다로운 위치에 배치된 생물학적 지표를 통해 확인해야 합니다. 이 마지막 단계에서는 향후 사용을 위해 1차 봉쇄를 재설정합니다.

규제 물류 탐색하기

폐기물 처리 물류는 병원균의 규제 분류에 따라 직접적으로 결정됩니다. 예를 들어, 선별 에이전트 규정은 7일 이내에 폐기해야 하는 엄격한 기한과 특정 운송 프로토콜을 부과하는 경우가 많습니다. 따라서 운영 계획은 규정 준수 전략과 분리할 수 없습니다. 아래 표에는 주요 노출 후 프로세스와 그에 따른 추진 요건이 요약되어 있습니다.

오염 제거 및 규정 준수 워크플로

노출 후 단계는 일련의 검증된 프로세스로, 각각 특정 규정 준수 드라이버를 통해 자료가 비감염성 상태로 유지되도록 합니다.

출처: 미생물학 및 생물의학 실험실에서의 생물안전(BMBL) 6판. BMBL은 모든 감염성 물질 및 폐기물에 대해 검증된 오염 제거를 요구하며, 특정 규제 프레임워크(예: 일부 에이전트)는 나열된 프로세스를 관리하는 엄격한 처리 일정을 부과합니다.

중요 위험 완화 전략 및 비상 계획

사전 예방적 의료 방어

위험 완화는 엔지니어링과 절차를 넘어서는 것입니다. 핵심 전략 계층은 오르토폭스 바이러스와 같은 특정 에이전트를 다루는 직원을 위한 노출 전 백신 접종입니다. 이를 통해 예방 접종을 개인 건강 조치에서 연속성 유지를 위한 운영 자산으로 재구성합니다. 이는 모든 연구를 중단시키고 광범위한 시설 오염 제거를 유발하며 심각한 평판 손상을 초래할 수 있는 실험실 내 감염을 예방합니다.

워크플로 내 세분화된 위험 평가

비상 계획은 단일 절차 내에서 다양한 위험 단계를 다루어야 합니다. 예를 들어, 감염된 동물의 진단 검체를 취급할 때는 세분화된 평가가 필요합니다. 병변 물질이나 폐 균질액은 혈청 샘플보다 에어로졸 위험이 더 높을 수 있으므로 특정 하위 단계에 대한 강화된 격리 프로토콜이 필요합니다. 효과적인 계획에는 이러한 미세한 위험을 매핑하고 그에 따라 계층화된 안전 프로토콜을 수립하는 것이 포함됩니다.

엔지니어링 및 시스템 중복성

기술적 비상 계획도 마찬가지로 중요합니다. 여기에는 예비 HEPA 필터나 네블라이저 부품과 같은 여분의 중요 구성품과 오염 제거와 같은 주요 프로세스에 대한 검증된 백업 방법을 준비하는 것이 포함됩니다. 자동화된 시스템 장애에 대한 계획은 필수적이며, 운영자는 격리 또는 연구 목표를 손상시키지 않고 수동 재정의 또는 대체 절차를 실행할 수 있도록 훈련받아야 합니다.

규정 준수를 위한 주요 규제 및 기술적 고려 사항

기본 가이드라인에 부합하기

규정 준수는 기술적 정확성과 규정 준수를 종합적으로 고려합니다. 전체 워크플로는 미생물학 및 생물의학 실험실에서의 생물학적 안전성(BMBL), 를 준수하며, 이는 ABSL-3 운영 기준과 관련 동물 복지 규정을 제공합니다. 이 기준은 검증된 엔지니어링 제어, 문서화된 직원 교육, 엄격한 기록 관리를 강조합니다. 다음과 같은 표준 준수 ISO 14644-1:2015 공기 청정도 분류는 격리 장치 성능을 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다.

봉쇄를 위한 기술 사양

기술적으로 규정 준수는 특정 성능 사양을 충족함으로써 입증됩니다. 여기에는 모든 폐수 공기 흐름에 대한 HEPA 필터링 배기, 검증된 액체 폐수 오염 제거 시스템, 실시간 노출 모니터링이 포함됩니다. 클래스 III BSC와 같이 격리 구역 내에서 사용되는 장비는 다음과 같은 관련 표준에 따라 설치 및 인증을 받아야 합니다. NSF/ANSI 49-2022. 이는 선택적 모범 사례가 아니라 라이선스 및 운영을 위한 필수 요건입니다.

모바일 고밀집의 미래

미래 지향적인 고려 사항으로는 이동식 모듈식 고밀도 격리 실험실의 등장이 있습니다. 운송 컨테이너 형식의 이러한 배치 가능한 BSL-3/4 장치는 고위험 연구에 대한 접근성을 민주화합니다. 영구적인 시설 투자 없이도 신속한 발병 대응과 전문 연구를 가능하게 하여 미래의 글로벌 보건 보안 전략과 파트너십 모델을 형성합니다. 또한 워크플로 검증과 시설 간 표준화를 위한 새로운 고려 사항을 도입합니다.

성공적인 ABSL-3 에어로졸 관리는 생리학적 데이터를 중요한 엔지니어링 입력으로 취급하고, 모든 절차에 동적 위험 평가 사고방식을 포함하며, 폐기물 물류가 규제 의무에 맞춰 설계되도록 하는 세 가지 통합 우선순위에 달려 있습니다. 자동화 및 모듈식 시스템으로의 전환은 운영 복원력 계획이 기술적 장애와 사이버 보안을 모두 해결해야 한다는 점을 더욱 요구합니다. 워크플로우는 각 단계의 검증이 다음 단계의 안전과 과학적 무결성을 뒷받침하는 복잡한 정밀성의 발레입니다.

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자주 묻는 질문

Q: 중앙 집중식 위험 관리 모델로 전환하면 ABSL-3 에어로졸 워크플로 계획에 어떤 영향이 있나요?
A: 최신 생물학적 안전 지침은 다음과 같이 반영되어 있습니다. 미생물학 및 생물의학 실험실에서의 생물안전(BMBL) 6판, 는 경직된 체크리스트를 넘어 역동적인 현장별 위험 평가 모델로 나아갑니다. 기관의 생물안전위원회는 장갑 무결성 검사부터 폐기물 취급에 이르기까지 각 절차 단계를 고유한 위험 프로필에 따라 평가해야 합니다. 즉, 사전 승인된 일반적인 프로토콜에만 의존하지 않고 지속적인 활동별 위험 평가를 통합하는 워크플로우를 설계해야 합니다.

Q: 서로 다른 실험실 구역 간에 동물 에어로졸 노출을 조정하기 위한 중요한 시설 설계 요건은 무엇인가요?
A: 효과적인 워크플로우를 위해서는 동물 시술 구역과 클래스 III BSC를 수용하는 캐비닛 실험실 간의 세심한 동기화가 필요합니다. 시설 설계는 실험실 간 조율을 핵심 운영 요건으로 우선시하여 포트를 통한 안전한 동물 이송을 보장하고 통과 고압 멸균기를 위한 통합 폐수 오염 제거를 확인해야 합니다. 새로운 시설을 설계하거나 기존 시설을 개조하는 프로젝트의 경우, 격리를 위반하지 않고 동물, 샘플 및 장비의 계획된 이동을 가능하게 하는 전용 공간과 검증된 시스템을 계획하세요.

Q: 동물의 호흡량을 측정하는 것이 단순한 데이터 수집 작업이 아니라 중요한 절차적 단계인 이유는 무엇인가요?
A: 혈량측정에서 계산된 분량(MV)은 정확한 목표 선량을 달성하기 위한 실시간 에어로졸 챌린지 시간을 직접 결정합니다. 따라서 생리적 데이터가 후속 고농도 노출의 매개변수를 결정하는 중요한 의존성이 생깁니다. 작업에서 정확하고 재현 가능한 투여가 필요한 경우, 워크플로우 유동성을 유지하고 수동 계산 오류를 제거하기 위해 MV를 에어로졸 제어 소프트웨어에 직접 공급하는 통합 데이터 시스템이 필요합니다.

Q: ABSL-3 에어로졸 챌린지 연구 이후 폐기물 처리 물류에 대한 계획을 어떻게 세워야 하나요?
A: 폐기물 처리 프로토콜은 병원체의 규제 분류(예: 엄격한 폐기 기한을 부과하는 선택 에이전트 규칙)에 따라 결정됩니다. 모든 오염된 폐기물은 제거하기 전에 유출수 오염 제거가 통합된 검증된 오토클레이브 사이클을 통해 멸균해야 합니다. 즉, 규제 대상 시약을 사용하는 임상시험의 운영 계획에는 규정 준수 중심의 일정과 운송 프로토콜이 통합되어야 하며, 폐기물 관리는 임상시험 계획의 단순한 물류적 요소가 아닌 전략적 요소가 되어야 합니다.

Q: 활성 시술 중 클래스 III BSC에서 찢어진 장갑을 관리하기 위한 권장 프로토콜은 무엇인가요?
A: 직원은 캐비닛 음압을 유지하면서 현장에서 즉각적인 오염 제거 및 교체 프로토콜을 실행할 수 있도록 훈련받아야 합니다. 이 접근 방식은 장갑 위반을 전체 시설 대피를 위한 자동 트리거가 아닌 특정 역량이 필요한 관리형 사고로 취급합니다. 팀의 교육이 표준 운영 절차에만 초점을 맞추고 있다면 운영의 연속성과 안전을 유지하기 위해 장비 고장에 대한 구체적인 비상 기술을 개발하고 훈련해야 합니다.

Q: ABSL-3 동물 실험에 사용되는 에어로졸 노출 시스템에는 어떤 기술 표준이 적용되나요?
A: 이러한 특수 시스템의 설계 및 운영은 다음과 같은 표준에 따라 안내됩니다. 공개 사용 가능한 사양(PAS) 2019:2019, 성능 및 안전 작동에 대한 사양을 제공합니다. 또한 전반적인 격리 환경에 대한 공기 청정도 및 입자 모니터링은 다음과 같은 분류에 부합해야 합니다. ISO 14644-1:2015. 노출 시스템을 선택하거나 검증할 때 공급업체가 이러한 관련 성능 및 안전 사양을 준수함을 입증하도록 요구해야 합니다.

Q: 직원 사전 노출 백신 접종은 전략적 위험 완화 도구로서 어떻게 작동하나요?
A: 특정 병원체(예: 수두 바이러스)에 대한 직원 백신 접종은 실험실 내 감염을 예방하여 운영의 연속성을 유지하기 위한 사전 예방 조치입니다. 이는 백신 접종을 개인 건강 조치에서 모든 연구를 중단시키고 광범위한 시설 오염 제거를 유발할 수 있는 사고로부터 보호하는 전략적 자산으로 재구성합니다. 백신으로 예방 가능한 약제를 다루는 시설의 경우, 기관 위험 관리 계획의 핵심 요소로 노출 전 백신 접종을 위한 예산을 책정하고 의무화해야 합니다.